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一、ELISA檢測人杯狀病毒

采用IDEIA? Norovirus試劑盒（DakoCytomation公司），僅限于檢測人杯狀病毒中的諾如病毒（屬）GⅠ和GⅡ型。

（一）檢測前準備工作

1.糞便標本處理：加入1ml樣品稀釋液（sample diluent）至1.5ml EP管中，加入0.1g固體糞便標本或0.1ml液體糞便標本，置于漩渦震蕩器混勻，室溫靜置10min，室溫下≥5000rpm離心5min。

2.陰性對照：將1ml樣品稀釋液（sample diluent）加至標記好的小瓶中作為陰性對照。

3.陽性對照：1ml對照稀釋液（control diluent）溶解陽性對照，使用前混勻。

4.洗液的配制：1倍體積的洗液濃縮液，加9倍體積的去離子H₂O。當天用當天配。

（二）標本檢測

1.    將需要數量的微孔板置于微孔板架上。

2.    每孔加入100μl 10％便懸液或陰性對照或陽性對照（每次檢測均需加一個陽性對照和一個陰性對照），20～30℃靜置60±5min。

3.    每孔加入2滴（或100μl）酶結合物（conjugate），用槍頭輕柔混勻。

4.    每孔加入350μl洗液，洗5次，在衛生紙上拍干。

5.    每孔加入2滴（或100μl）底物液（Substrate），20～30℃靜置30min。待藍色顯現后迅速觀察顏色。

6.    每孔加入2滴（或100μl）終止液（Stop solution），充分混勻。

7.    讀取OD450值，打印輸出或記錄OD值。結果必須在加入終止液后30min內讀取。

(三) 檢測結果的判定：

1.    陰性對照：肉眼觀察無色或OD450值<0.15。

2.    臨界值：OD450值＝陰性對照OD450值＋0.10。

3.    陽性對照：肉眼觀察呈現獨特的藍色或OD450值>0.50。

4.    標本：肉眼觀察藍色比陰性對照顏色深判定為陽性，肉眼觀察無色判定為陰性；或者OD450值大于臨界值判定為陽性，小于臨界值判定為陰性，OD450值在臨界值±0.01范圍內判定為可疑，應重復檢測。

（四）注意事項：

1.打開后的96微孔板應置于可封口的有干燥劑的口袋中貯存于2～8℃，打開后6周內用完。

2.終止液中含0.3mol/L硫酸，避免接觸到皮膚和粘膜。如果終止液接觸到這些部位立即用水沖洗。

3.未用完的陽性對照可在2～8℃貯存1個月，長期貯存應分裝存于-20℃。

4.底物液避光保存，不要使用已經變藍的底物液。

5.避免污染。

二、人杯狀病毒RT-PCR檢測

可以同時檢測出人杯狀病毒中諾如病毒（屬）和扎如病毒（屬）。

（一）病毒RNA提取：

1．提取前的準備工作：

（1）    將1ml Buffer AVL加入裝有低壓凍干的Carrier RNA中，徹底溶解Carrier RNA后，將溶有Carrier RNA的Buffer AVL轉入至Buffer AVL瓶中，徹底混勻。分裝貯存于2～8℃。如果在2～8℃時，Buffer AVL/Carrier RNA溶液形成沉淀，可在80℃重新溶解，注意加熱的時間不能超過5min，用前冷卻至室溫。Buffer AVL/ Carrier RNA溶液不能加熱超過6次。

（2）    加入合適比例的96～100％的酒精至Buffer AW1中，19ml的Buffer AW1加入酒精25ml。

（3）    加入合適比例的96～100％的酒精至Buffer AW2中，13ml的Buffer AW2加入酒精30ml。

2．病毒RNA的提取：

（1）    在1.5ml EP管中加入560μl 已加入Carrier RNA的Buffer AVL。

（2）    將140μl 10％便懸液加入至EP管中的Buffer AVL中，vortex混勻15sec。

（3）    室溫（15～25℃）孵育10min。

（4）    將1.5ml EP管輕微離心，以去除管內的液滴。

（5）    在管內加入560μl 96～100％的酒精，vortex混勻15sec。混勻后，將1.5ml EP管輕微離心，以去除管內的液滴。

（6）    小心的將630μl步驟5中的溶液加入至已放入至2ml收集管中的QIAamp離心柱中，注意不要弄濕柱子邊緣。蓋上蓋子，8000rmp離心1min。將QIAamp離心柱放置至另一干凈的2ml收集管中，棄去包含有濾過液的收集管。

（7）    小心打開QIAamp離心柱的蓋子，重復步驟6。

（8）    小心打開QIAamp離心柱的蓋子，加入500μl Buffer AW1。蓋上蓋子，8000rmp離心1min。將QIAamp離心柱放置至另一干凈的2ml收集管中，棄去包含有濾過液的收集管。

（9）    小心打開QIAamp離心柱的蓋子，加入500μlBuffer AW2。蓋上蓋子，14,000rmp離心3min。棄去收集管中的濾過液，14,000rmp離心空柱子1min。

（10）將QIAamp離心柱放置入干凈的1.5ml離心管中。棄去包含有濾過液的收集管。小心打開QIAamp離心柱的蓋子，加入60μl Buffer AVE至離心柱中，蓋上蓋子，室溫孵育1min。8000rmp離心1min。（2×40μl的Buffer AVE洗脫兩次，能增加產量。）病毒RNA進行反轉錄，或貯存于－20℃或－70℃備用。

（二）人杯狀病毒ssRNA的反轉錄：

在0.2mlEP管中配制如下逆轉錄體系。

10×緩沖液                        2.5 μl

25 mM MgCl2                        4 μl

2.5mM dNTPs                         5μl

1% BSA                                2.5μl

0.2 μg/ μl引物289混合液        1μl

10 U/μl AMV-RT                0.35μl

50 U/μl RNasin                      0.1μl

DEPC處理H2O                  8.05μl

RNA                                      1.5μl

共25μl，混勻，輕微離心，42℃反轉錄1hr。

（三）人杯狀病毒cDNA PCR擴增

在0.2ml EP管中配制如下PCR體系：

10×緩沖液　　　　　　　　5μl

25mM MgCl2　　　　　　　 4μl

10mM dNTPs　　　　　　　 1μl

0.2 μg/ μl引物289混合液　 1μl

0.1μg/ μl引物290混合液　　1μl

5 U/μl Taq酶　　　　　 0.4 μl

DEPC處理H2O　　　　　  29.6μl

cDNA　　　　　　　　　    8μl

共50μl，混勻，輕微離心，放入PCR儀中擴增，反應條件：94℃變性3min后，94℃ 60s，58℃1min20s，72℃1min，進行30個循環，72℃延伸10min。反應結束后1.5％瓊脂糖凝膠電泳或4℃保存PCR產物。

表1  人杯狀病毒RT-PCR所用的引物

引物	位置	方向	核酸序列(5’–3’)
289H	4865-4886	-	TGACGATTTCATCATCACCATC
289I	4865-4886	-	TGACGATTTCATCATCCCCGTC
290H	4568-4590	+	GATTACTCCAGGTGGGACTCCAC
290I	4568-4590	+	GATTACTCCAGGTGGGACTCAAC
290J	4568-4590	+	GATTACTCCAGGTGGGATTCAAC
290K	4568-4590	+	GATTACTCCAGGTGGGATTCCAC

（四）檢測結果的判定：

取15μl RT-PCR擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。人杯狀病毒諾如屬擴增產物大小為319bp，扎如屬擴增產物大小為331bp。

（五）注意事項：

1.    槍頭避免觸及QIAamp離心柱的濾過膜。

2.    避免污染。應該戴手套進行操作。PCR實驗室應該分為3個區：試劑準備區，樣品準備區，擴增和檢測區。

3.    EB可能致癌，必須小心操作，劃定EB污染區。