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鄉鎮衛生院結核病痰涂片檢查點設置及實驗室操作規程
在以縣（市）為單位實施現代結核病控制策略（DOTS）的地區，通過在鄉鎮衛生院設置結核病痰涂片檢查點（以下簡稱查痰點），方便肺結核可疑癥狀者和疑似肺結核病人的就診查痰，以達到提高涂陽肺結核病人發現率，縮短傳染性肺結核病人的就診延誤和治療延誤時間，降低結核病傳播的目的。
一、鄉鎮衛生院查痰點工作職責
（一）鄉鎮衛生院查痰點負責轄區及周圍鄉鎮肺結核可疑癥狀者和疑似肺結核病人的痰檢工作。
（二）查痰點是結核病診斷的初篩單位，凡痰涂片陽性病人或痰涂片陰性但高度懷疑肺結核者需轉至縣級結防機構進一步檢查確診。
（三）鏡檢陽性的痰涂片2日內應得到縣級結防機構實驗室確認，陰性涂片一周內應得到縣級結防機構實驗室的復驗。痰涂片的轉送方法可根據當地情況決定。
（四）鄉鎮衛生院查痰點實驗室須按要求做好痰涂片保存和各項資料的登記、統計管理工作。
二、查痰點的基本要求
（一）痰涂片檢查點首先應做好實驗室工作用房的準備，根據鄉鎮衛生院現有工作用房進行合理調整和布局。實驗室面積不小于10平方米，按功能劃分為操作區，用于痰涂片制備、染色，相對潔凈區，用于鏡檢、登記等。
（二）依據《病原微生物實驗室生物安全管理條例》規定，查痰點實驗室須具備開展痰涂片檢查工作的水源、消毒、污物處理等一般檢驗條件。
（三）查痰點需有專人負責，技術人員須經培訓合格后方可從事痰涂片檢查工作。
（四）查痰點需配備雙目顯微鏡一臺（含100倍油鏡）和紫外線燈；上級結核病防治機構統一配備的染色試劑、登記本、檢驗單、玻片、痰盒等日常工作物品。
（五）已具備上述基本條件的查痰點，經地（市）級和縣級結核病防治機構驗收合格，并經縣級結核病防治機構上報省、地（市）級結防機構備案后即可開展工作。
三、檢查對象
就診及轉診的疑似肺結核病人,一般包括持續咳嗽、咳痰超過3周；咳血或伴有血痰；發熱或胸痛超過2周；胸部X線檢查異常。
四、檢查程序
（一）接診病人：對所有肺結核可疑癥狀者和疑似肺結核病人，應在內科或呼吸科門診進行登記，由門診醫生開具三張痰涂片檢查單（附表3）。
（二）痰標本收集：在三個痰標本盒上注明病人的姓名、編號、檢查日期和容器序號。病人首次留痰前應指導病人，留取“即時痰”、“夜間痰”、“晨痰”合格的痰標本，對所送不合格痰標本除常規檢查外，應要求患者重新送檢。
（三）實驗室登記：按照年度病人序號和痰標本序號在實驗室登記本上進行登記（見附表4），并以同樣的號碼在痰涂片檢查單上進行標記。檢驗單的病人姓名應與實驗室登記本一致。
（四）痰涂片檢查：對病人送的痰標本應及時按操作規程進行涂片、染色和顯微鏡檢查。
（五）痰涂片檢查結果登記與報告：及時在登記本上登記痰涂片檢查結果。當病人的三次痰涂片檢查完成后，發現有陽性痰涂片，應在規定時間內報縣結核病防治機構，縣級結核病防治機構應及時對痰涂片進行確認。
（六）痰涂片的保存：每個查痰點鏡檢后的全部痰涂片應按實驗室登記本序號連續排列，分別存放在各點固定的玻片盒中，供上級實驗室復核確認。
（七）痰檢質量控制：每個痰涂片檢查點均按照中國結核病防治規劃《痰涂片鏡檢質量保證手冊》的要求，作為一個獨立的被質控單位接受室間質量評估和檢查工作。
五、痰涂片抗酸染色檢查法
（一）痰標本的采集
肺結核可疑癥狀者或肺結核病人送痰時，醫護人員或痰檢人員應向病人解釋，使病人充分了解留好痰標本的重要性，并指導病人如何從肺部深處咳痰。采集痰標本時應在遠離人群的開放空間進行，或在通風良好的室內進行。標本量一般在3～5 ml。
1、痰標本盒：應采用WHO推薦的國際通用螺旋蓋痰瓶，或可密封塑料盒、蠟紙盒收集痰標本。痰標本盒上注明病人姓名、編號、檢查項目和容器序號“1”、“2”、“3”（1為當日即時痰，2為夜間痰，3為次日晨痰）。
2、痰標本的性狀：合格的痰標本應是患者深呼吸后，由肺部深處咳出的分泌物。合格的痰標本包括干酪痰、血痰、粘液痰。唾液或口水用于病人確診時為不合格痰標本。
（1）干酪痰 標本外觀以黃色(或奶酪色)、膿樣、團塊狀的肺部分泌物為主，粘度較粘液痰低，制片時較易涂抹；涂片染色后鏡檢，可發現大量膿性炎癥細胞、肺上皮脫落細胞。由于此類標本是由肺部深處咳出，對肺結核的診斷最有價值，故抗酸桿菌陽性檢出率較高。
（2）血痰 此類標本是因粘液痰或干酪痰標本中混有血液而形成，顏色為褐色或深褐色、鮮紅色或伴有血絲；涂片染色后鏡檢除能夠觀察到粘液痰或干酪痰的細胞特征外，含新鮮血液的標本中可見到被染色的血細胞。由于含血標本易干擾抗酸桿菌鏡檢的結果，故在制片時應盡量避免挑取含血標本。
（3）粘液痰 標本外觀以白色、粘稠度較高的肺部和支氣管分泌物為主，制片時需仔細涂抹；涂片染色后鏡檢時，鏡下可見支氣管內膜纖毛柱狀上皮細胞，伴有少量肺上皮脫落細胞、膿性炎癥細胞、口腔脫落細胞及口腔寄生菌。此類標本的抗酸桿菌陽性檢出率較唾液高。
（4）唾液 目視觀察標本整體外觀，以透明或半透明水樣、粘度較低的口腔分泌物為主，標本中有時伴有氣泡；涂片染色鏡檢時，鏡下可見少量口腔上皮脫落細胞和口腔內寄生菌，有時可見食物殘渣。由于此類標本進行抗酸桿菌檢查時的陽性檢出率很低，用于對患者確定診斷時是不合格的標本。所以，當病人初次留痰即為唾液時，應囑病人重送并指導病人如何留取合格標本。
3、痰標本采集時間：根據痰標本的采集時間，將痰標本分為三類：
（1）即時痰 病人就診時深呼吸后咳出的痰液。應確保每個初次就診病人均留取即時痰進行檢查。
（2）晨痰 患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口和第3口痰液。
（3）夜間痰 送痰前一日，患者晚間咳出的痰液。
（二）痰涂片制作
1、在進行痰涂片檢查前對新的玻片用95%的乙醇擦拭（或浸泡）脫脂，經干燥、清潔、檢查無油污、無劃痕后作為合格的玻片備用。在已經準備的痰玻片背面左端的1/3處注明編號 (如使用的載玻片一端無磨砂面，使用玻璃刻刀注明編號；如使用的載玻片一端有磨砂面，可使用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫)。
2、小心打開痰標本盒，防止產生氣溶膠或使標本外溢。仔細觀察標本，使用折斷的竹簽茬端，挑取痰標本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.05～0.1 ml，于玻片正面右側2/3處，均勻涂抹成10×20 mm的卵圓形痰膜。痰膜朝上靜置自然干燥后(一般約需要30分鐘)進行染色鏡檢。當氣溫低，痰膜不易干燥時，嚴禁將玻片直接在火焰上烘拷，以防產生氣溶膠或痰膜脫落。一張載玻片上只能涂抹一份痰標本，一張載玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于痰涂片染色檢查。
3、涂抹完畢后的痰標本，在檢查結果報告前，應暫時保留。以備涂片、染色不合格影響鏡檢結果時，重新涂片和染色之用。
（三）萋－尼氏染色
1、涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片間距保持在10 mm以上的距離；火焰固定(在5秒鐘內將玻片置于火焰上來回烘烤4次)。
2、滴加石碳酸復紅染液，蓋滿痰膜，火焰加熱至出現蒸汽后，脫離火焰，保持染色5分鐘。染色期間應始終保持痰膜被染色液覆蓋，必要時可續加染色液。加溫時勿使染色液沸騰。
3、流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染色液，瀝去標本上剩余的水。
4、自痰膜上端外緣滴加脫色劑布滿痰膜，脫色1分鐘；如有必要，需流水洗去脫色液后，再次脫色至痰膜無可視紅色為止。
5、流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去脫色液，瀝去玻片上剩余的水。
6、滴加亞甲藍復染液，染色30秒鐘。
7、流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去復染液，瀝去標本上剩余的水。待玻片干燥后鏡檢。
一張染色合格的痰玻片，由于被亞甲藍染色而呈亮藍色。將染色后的玻片放置在報紙上，如果報紙上的文字透過痰膜不能被看清，表明該玻片涂抹過厚。
（四）顯微鏡檢查
1、使用10倍目鏡雙目顯微鏡讀片。
2、取染色完畢且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片臺上并以卡尺固定。首先使用40倍物鏡，轉動卡尺移動玻片至痰膜左端，將光線調節至適當亮度，調節焦距至可見細胞形態；移開40倍物鏡，在玻片上滴1～2滴鏡油，使用100倍油鏡進行細致觀察。在淡藍色的背景下，抗酸菌呈紅色，其他細菌和細胞呈藍色。為防止抗酸桿菌的交叉污染，嚴禁鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。
3、讀片方法：首先應從左向右觀察相鄰的視野；當玻片移動至痰膜一端時，縱向向下轉換一個視野，然后從右向左觀察，依此類推。通常10×20 mm大小的痰膜，使用100倍油鏡，每行可觀察100個視野，觀察三行則約為300個視野。仔細觀察完300個視野，一般至少需要5分鐘以上。一位鏡檢人員連續閱讀10-12張玻片后應休息約20分鐘。
4、分枝桿菌的基本形態：當患者標本直接進行涂片鏡檢時，能夠發現不同種的分枝桿菌形態。結核分枝桿菌多數為桿狀、稍彎曲；菌體寬度0.3～0.6μm；菌體長度不一，在0.5～8μm之間，多數在1.5～3.5μm；含結核分枝桿菌較多的新鮮標本經萋－尼氏染色后，100倍油鏡觀察，可見單個存在的，也能看到聚集成簇或分枝狀排列的菌體，染色良好痰標本，可見菌體內著色較深的異染顆粒。
（五）鏡檢結果報告與登記
痰涂片鏡檢的結果報告，不僅是對結核病的診斷提供依據，報告的數量也一定程度的反映疾病嚴重程度和傳染性的大小。痰涂片鏡檢結果的登記應按照鏡檢結果的分級報告標準登記在結核病細菌學實驗室登記本上和痰檢驗單上。不能只填寫陰性、陽性或(－)、( + )等。
萋尼氏染色鏡檢結果分級報告標準
抗酸桿菌陰性 (－)：連續觀察300個不同視野未發現抗酸桿菌。
報告抗酸桿菌菌數：1～8條/300視野。
抗酸桿菌陽性（1＋）：3～9條/100視野。
抗酸桿菌陽性（2＋）：1～9條抗酸桿菌/10視野。
抗酸桿菌陽性（3＋）：1～9條抗酸桿菌/每視野。
抗酸桿菌陽性（4＋）：≥10條抗酸桿菌/每視野。
（六）抗酸染色玻片的處理
閱讀完萋尼氏染色玻片后，應立即用浸滿二甲苯（分析醇）的擦鏡紙揭取數次，徹底去除玻片上的鏡油。經脫油干燥后的玻片，按實驗室序號及涂片編號放置在玻片盒中，存放在陰涼干燥的環境中，以備復檢或質控抽檢。
六、痰涂片抗酸染色檢查注意事項
痰涂片抗酸染色檢查要注意預防假陽性和假陰性結果的產生。假陽性是指將陰性涂片錯誤判讀為陽性，假陰性是指將陽性涂片錯誤判讀為陰性。屬于技術因素的影響要通過一系列實驗室內和實驗室間的質量控制不斷改善。
（一）假陽性結果的預防措施
1、必須使用新的載玻片進行痰涂片檢查。
2、每個標本均使用一個新竹簽完成制片涂抹。
3、所有染液均經過過濾。
4、染色時玻片彼此之間保持一定距離，相互徹底分隔開。
5、嚴禁使用染色缸將玻片放置一起染色。
6、染色時勿使玻片上的染液干燥。
7、滴加鏡油時，嚴禁容器滴口直接接觸玻片痰膜。
8、嚴禁物鏡鏡頭直接接觸玻片痰膜。
9、完整、準確的標注痰盒、玻片和實驗室登記本的各項內容。
10、登記前、后對檢驗單和標本盒上的標注進行仔細核對。
11、認真按照要求讀片，準確記錄和報告結果。
（二）假陰性結果的預防措施
1、確認標本是痰而非唾液。
2、確認每份標本至少有3 ml。
3、選擇膿樣、干酪樣、粘液分泌物涂抹制備玻片。
4、制備玻片時標本涂抹均勻，不要太厚或太薄。
5、使用高質量染料、嚴格按照配方配制染液。
6、嚴格按照操作程序完成染色過程。
7、判斷結果為“陰性”前，必須閱讀規定要求的視野數。
8、作為對照，可采用已知結果為陽性的玻片，完成染色鏡檢過程。
9、完整、準確地標注痰盒、玻片和實驗室登記本。
10、登記前對檢驗單和標本盒上的標注進行仔細核對。
11、準確記錄和報告結果。
七、痰玻片的保存
（一）鏡檢后的涂片應及時用浸滿二甲苯的擦鏡紙徹底去除涂片上的鏡油。
（二）再次核對實驗室登記本與每張涂片實驗序號。
（三）嚴禁在涂片上標記鏡檢的陰、陽性結果。
（四）按實驗室登記本序號連續排列全部涂片，存放于玻片盒內。
（五）涂片保存與實驗室登記本記錄應保持一致。初診病人第一張涂片存入涂片盒后需預留出兩個空位置，以備第二張、第三張涂片檢查后放入。
（六）保存近期3個月的全部痰涂片待各級實驗室質量控制抽檢，如果年涂片量不足500張，必須全部保存。
（七）裝滿涂片的玻片盒，需用標簽注明涂片實驗序號區間和日期區間，以便日后盲法復檢或現場評價時抽樣。
八、實驗室管理
（一）顯微鏡日常維護
顯微鏡作為發現涂片陽性病人的重要設備，實驗室工作人員應正確使用并給予正確維護，以保證其正常工作和延長使用壽命。在使用和維護顯微鏡時應特別遵守下列要點：
1、顯微鏡應放置在干燥、無塵和通風的環境中。如果顯微鏡一段時期內停止使用，應拆開并放置在原包裝盒內，并放置有效的干燥劑。
2、使用前和使用后必須使用擦鏡紙徹底清潔物鏡。
3、嚴禁物鏡鏡頭直接接觸玻片上痰膜。
4、使用油鏡時，只能使用細螺旋調節焦距。
5、使用電光源顯微鏡時，注意電壓和電流是否與儀器要求相匹配。
（二）耗材供應與管理
為保障痰涂片檢查工作能夠連續不斷開展，應儲存一定數量的實驗耗材和相應試劑，儲備量可根據工作量來進行計算，一般應準備比平均工作量高20％的相應耗材和試劑。染色試劑應由省結核病參比實驗室或經省級結核病參比實驗室進行了質量控制的地（市）級結核病參比實驗室組織統一配制和供應，其它耗材可根據當地情況由省、地或縣統一供應。各項物資、耗材按照需要供應，并保證達到質量要求。
（三）實驗室人員安全防護
1、嚴格遵守實驗室安全操作規程，實驗室的技術人員必須經過生物安全培訓后方可上崗。
2、嚴格遵守實驗室安全操作規程，警惕分枝桿菌氣溶膠的產生。
3、實驗室應嚴格限制非實驗室人員進入，減少實驗室內外交叉生物污染。完成實驗工作離開實驗室，要關好門窗。
4、進入實驗室，盡量避免攜帶非必需物品。實驗臺上不放任何與實驗無關的物件或私人用品。
5、工作人員進入實驗室，應穿工作服并注意著裝整齊，操作時應戴口罩、帽子和手套，長發者須將頭發裝束在帽子內。
6、實驗室內應保持肅靜，試驗過程中禁止一切與試驗無關的活動，以保證集中精力完成實驗操作。
7、實驗室內禁止吸煙、飲食及用嘴濕潤鉛筆或標簽等，也不要以手撫摩頭面部等。
8、實驗前須開啟紫外燈對實驗室和操作區域進行照射消毒1小時以上；實驗結束后，開啟紫外燈對操作區和實驗室進行照射消毒2小時以上。
9、實驗結束后，操作人員要用清潔劑（或肥皂）和清水充分洗凈。
10、每次實驗操作終止后，必須清理好實驗臺，所有物品歸位并用70%酒精或3-5%石碳酸等有效消毒劑擦洗實驗臺和地面。
11、實驗室中的生物危險物要根據檢查項目和性質的不同，局限在相應的實驗室或試驗區域內，不得隨意將其帶到其它區域進行。
（四）污物消毒與處理
1、痰標本、被污染的一次性用品及實驗室垃圾應經高壓滅菌后丟棄，或者使用專用的焚燒爐或固定的垃圾坑進行焚燒。
2、每次完成檢查后，操作臺和實驗區域內經紫外燈近距離照射消毒2小時以上。
3、實驗過程中，如標本被打翻污染了操作臺或地面，應以大于污染面積的紗布或衛生紙吸滿5%的苯酚溶液或70%酒精，覆蓋污染區，30分鐘后方可移去，再經紫外線近距離照射。
附表：1、鄉鎮衛生院痰檢人員培訓記錄表
2、基本情況調查表
3、檢驗單參考式樣
4、結核病細菌學實驗室登記本
《鄉鎮衛生院結核病痰涂片檢查點設置及實驗室操作規程》
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